对接软件
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Hex Protein Docking算法复杂且每次耗时极长，ZDock一般作为前期的初对接，rDock为ZDock的升级算法，一般将ZDock对接后的前几个得分构象使用rDock进行进一步对接。
算例及结构预处理
Rosetta给的官方教程：Protein-Protein Docking为Colicin-D与其抑制剂IMM之间的对接，相关文件在/demos/tutorials/Protein-Protein-Docking。需要提供两个精炼的输入文件COL_D.pdb和IMM_D.pdb文件，以及1v74.pdb文件在input_files文件夹下，准备的方法详细可以查看输入和输出一章的准备结构一节。
若模型为同源建模等方法进行构建，可以首先进行一个结构的relax,当然也可以用其他软件进行制作。若您的模型为同源建模等进行的，模型评价效果不理想可以采用GROMACS等软件进行能量最小化的工作。 若模型质量佳或为解析结构，结构准备更多的是为了将输入结构转化为Rosetta的标准规范，官网给了一个简单的例子：/demos/tutorials/input_and_output/flag_input_relax
$ROSETTA3/bin/relax.default.linuxgccrelease -in:file:s input_files/from_rcsb/1qys.pdb @flag_input_relax
集群上使用mpirun，类似mpirun relax.mpi.linuxgccrelease @XXX或mpirun docking_protocol.mpi.linuxgccrelease @flag_local_docking
-nstruct 2
-relax:constrain_relax_to_start_coords
-relax:ramp_constraints false
-ex1
-ex2
-use_input_sc
-flip_HNQ
-no_optH false
参数说明：
- in:file:s #输入数据
- nstruct #增大数值可以提高模型结果的质量，如nstruct 10将会获得10个模型。
- constrain_relax_to_start_coords #约束重原子，从而使得骨架较初始不会移动太多。
- ramp_constraints false #设为false则不进行倾斜约束（PS：官方文档上有说明进行整体约束该选项需要设置为false）
- use_input_sc #turns on inclusion of the current rotamer for the packer
- flip_HNQ #在氢键原子位置优化期间考虑翻转HIS，ASN，GLN。
- no_optH #表示是否在PDB加载期间进行氢原子位置优化。 一般后面5个设置为基本设置
局部对接
局部对接就是假设已知两个蛋白的结合（口袋）区域。首先我们需要将两个蛋白放在同一个pdb文件中，结合口袋大致的对着对方约10埃的位置。
-in:file:s input_files/col_complex.pdb
-in:file:native input_files/1v74.pdb
-unboundrot input_files/col_complex.pdb
-nstruct 1
-partners A_B
-dock_pert 3 8
-ex1
-ex2aro
-out:path:all output_files
-out:suffix _local_dock
参数说明：
- in:file:s #输入数据
- in:file:native #native file，与该文件进行计算比较
- nstruct #请注意在进行实际数据分析时，此处的值应当至少为500
- partners #partners A_B意味着，链B对接进入链A。当受体链和配体链同时有多条时，例如AB，LH，则为
-partners LH_AB - dock_pert #移动步长，dock_pert 3 8意味着，在开始单独的模拟之前随机的将配体（链B）进行一个3埃的平移和8度的旋转
- ex1 #使第一和第二侧链二面角的采样增加一个标准偏差
- out:path:all #输出路径
- out:suffix #输出文件名后缀
注：
- 链B对接进入链A；
- 在开始单独的模拟之前随机的将配体（链B）进行一个3埃的平移和8度的旋转。
- 若为对接的多链蛋白（如一个蛋白为链A和B，一个为链L和H） 那么设置为-partners LH_AB即可。
- 同时想和1v74.pdb进行计算比较。
$ROSETTA3/main/source/bin/docking_protocol.linuxgccrelease @flag_local_docking
大约1min即可完成，请确保-nstruct 500或者更大的设置
局部优化对接结构（local refine）： 一些小的冲突可能导致蛋白对接的得分非常高（越小越好），在Relax之前我们需要对界面处进行一定的修复。因为已经对接完成，我们需要避免大的蛋白移动。所以我们跳过之前的第一步（质心步骤）而仅进行第二部分计算。我们替换局部对接的flags:
-in:file:s input_files/1v74.pdb
-nstruct 1
-docking_local_refine
-use_input_sc
-ex1
-ex2aro
-out:file:fullatom
-out:path:all output_files
-out:suffix _local_refine
参数说明：
- docking_local_refine #对接模式
- use_input_sc #使用之前对接生成的打分文件
- out:file:fullatom #输出文件包含所有原子
$ROSETTA3/main/source/bin/docking_protocol.linuxgccrelease @flag_local_refine
运行完local refine后，就可以使用relax对对接结果进行优化处理了，命令如第一步使用relax预处理。
全局对接
若没有蛋白结合位点的信息，则使用全局对接。全局对接假设蛋白质为球型，而更小的蛋白质配体围绕蛋白质受体寻转，其原理个人理解与rDock双球对接类似。因为其随机起始位置，故输入的结构位置显得不是那么重要。全局对接对小复合物相对较好（残基数小于450）。采样样本量更加大，故为了得到精确的结果，需要大量的运行，一般高达10,000-100,000次。 RosettaDock是基于MCM的对接算法，并不同于其他的刚性对接软件，其并不擅长于全局对接，因为整体过程的计算效率太低，因此在进行RosettaDock之前，一般会使用ZDOCK、ClusPro等进行预对接确定结合口袋然后再运行局部对接，进行初步地构象摸索后选取一个或多个看起来比较合理的构象作为出发。
-in:file:s input_files/col_complex.pdb
-in:file:native input_files/1v74.pdb
-unboundrot input_files/col_complex.pdb
-nstruct 1
-partners A_B
-dock_pert 3 8
-spin
-randomize1
-randomize2
-ex1
-ex2aro
-out:path:all output_files
-out:suffix _global_dock
$ROSETTA3/main/source/bin/docking_protocol.linuxgccrelease @flag_global_docking
参数说明：
- unboundrot #将指定结构的旋转异构体添加到旋转异构体库中
- nstruct #请注意在进行实际数据分析时，此处的值应当为 10,000~100,000
- randomize1 #表示对受体（蛋白1）进行随机取样
- randomize2 #表示对配体（蛋白2）进行随机取样
柔性对接
对于柔性蛋白对接，rosetta采用的是使用centroid模式对受体和配体进行构象采样，以受体或配体的构象集（ensemble）作为对接的输入，至于蛋白的构象集，可以使用非限制性的relax来实现，因为relax本身就是一个对蛋白结构进行采样（sample）程序。 Rosetta假设蛋白骨架为柔性的进行对接。其假设蛋白蛋白结合过程前后构象发生了较大的变化，我们对蛋白构象簇（ensembles ）进行对接。而不是像之前一般一个配体构象和一个受体构象。在蛋白对接第一步（质心步骤）我们在构象簇中不断的变化着来进行对接。这样可以相当于固定骨架与多个骨架之前进行采样。 这个簇可以使用无约束的relax进行完成。对于这个教程我们使用小簇- 3 COL_D 和 3 IMM_D构象。在设置其为输入文件之前要确认链名和残基数量每个簇中都一样。 簇的设置类似如下： 首先，在做柔性对接前，我们要按以下格式分别准备受体及配体的构象列表，名词为xxx_ensemblelist，这个列表类似于蛋白列表输入：
xxx_ensemblelist:
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0001.pdb
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0002.pdb
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0003.pdb
IMM_D_ensembel情况类似，-ensemble必须包含蛋白质PDB列表。即使有一个蛋白只有一个构象，两个ensemble也都要申明,可以使用指令批量导入：
ls input_files/COL_D_ensemble/*.pdb > COL_D_ensemblelist
ls input_files/IMM_D_ensemble/*.pdb > IMM_D_ensemblelist
在对接之前我们还要进行一步前处理（prepacking），对两蛋白集分别进行prepacking。前处理可以消除由于构象异构体而产生的不同能量贡献，方便下一步dock的进行。其设置与对接类似类似，仅仅删除-dock_pert设置. 其大约运行30s，将会得到prepacked PDBs文件，以及规范化的质心得分和全原子得分，
-in:file:s input_files/col_complex.pdb
-in:file:native input_files/1v74.pdb
-unboundrot input_files/col_complex.pdb
-nstruct 1
-partners A_B
-ensemble1 COL_D_ensemblelist
-ensemble2 IMM_D_ensemblelist
-ex1
-ex2aro
-out:path:all output_files
-out:suffix _ensemble_prepack
prepack运行完毕，xxx_ensemblelist会被重新编辑，更改后的格式如下：
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0001.pdb.ppk
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0002.pdb.ppk
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0003.pdb.ppk
0.77058
0
1.00377
-93.3588
-94.2715
-93.9065
prepack运行后，就可以执行柔性对接了，对接命令为： flag_ensemble_docking:
-in:file:s input_files/col_complex.pdb
-in:file:native input_files/1v74.pdb
-unboundrot input_files/col_complex.pdb
-nstruct 1
-partners A_B
-dock_pert 3 8
-ensemble1 COL_D_ensemblelist
-ensemble2 IMM_D_ensemblelist
-ex1
-ex2aro
-out:path:all output_files
-out:suffix _ensemble_dock
$ROSETTA3/main/source/bin/docking_protocol.linuxgccrelease @flag_ensemble_docking
柔性对接的结果好坏取决于构象取样的多少，同时，伴随着构象数增多，程序运行时间也会变长，为保证效果，推荐-nstruct设置大于5000。
对接结构分析： 我们在关注total_score的同时，应该更多的关注I_sc，这一项描述的是蛋白界面相互作用得分(interface score,-2~-10)，而且I_sc仅限于体系内比较，对于不同体系的蛋白，I_sc没有比较意义。
参考
- Rosetta快速入门指引
- 上海交大超算平台用户手册 Rosseta
- 小康学习 Rosetta蛋白蛋白对接
- 听雨：ROSETTA使用技巧随笔–蛋白蛋白对接
- RosettaDock: 蛋白-蛋白复合物对接预测
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